乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)为一种嗜肝DNA病毒，其感染具有种属特异性和组织特异性，人类HBV仅感染人和高等灵长类动物，具有肝组织特异性，这在一定程度上限制了人们对HBV在致病机制和防治等HBV相关的医药生物学问题的研究。
近年来，国内外采用转基因技术，建立了多种HBV单基因或全基因组的转基因小鼠模型，这部分解决了HBV小鼠模型缺乏的局面，但是由于全基因组转基因小鼠血清和组织(尤其是肝组织)中有HBV病毒蛋白的表达和病毒的复制，因此，在普通实验室进行全基因组转基因小鼠的培育和其他研究具有一定的危险性，且常规分子生物学方法和免疫组织化学的方法检测有代价较高、费时费力的限制。因此，建立一种便于检测和培育的全基因组小鼠具有一定的实际应用价值。建立一种全身组织可表达绿色荧光蛋白(GFP)的全基因组转基因小鼠，可以简化转基因小鼠的检测和培育。
通过本课题的研究，得到GFP标记的HBV真核表达载体，并利用其制备转基因小鼠。
本研究采用基因重组技术，将pBR322HBVadr2.0质粒(含有双拷贝的HBV全基因组DNA)和pCXEGFP质粒(含CMV-IEenhancer和Chickenβ-actionpromoter调控的EGFP基因)分别用限制性内切酶PvuⅡ和BamHⅠ酶切，T4DNA多聚酶将粘性末端平端化后，再用限制性内切酶SalⅠ酶切，胶回收得到EGFP和HBVadr2.0片段，连接后构建成pCXEGFP-HBVadr2.0真核表达质粒。经限制性内切酶酶切和DNA序列测定，证实该载体构建成功。为了研究pCXEGFP-HBVadr2.0载体的体外表达特征，将该载体线性化后，采用脂质体转染方法将其转染人胎肝细胞系L02，无限稀释法获得稳定遗传pCXEGFP-HBVadr2.0的L02阳性细胞，荧光显微镜观察表明pCXEGFP-HBVadr2.0可在L02细胞中表达绿色荧光蛋白，进一步采用RT-PCR和免疫细胞化学的方法从转录水平和蛋白水平检测HBs基因和HBc基因的转录和表达情况，结果显示，HBs基因和HBc基因可在稳定遗传pCXEGFP-HBVadr2.0的L02阳性细胞中转录和表达。为了证实pCXEGFP-HBVadr2.0在小鼠体内的表达情况，该研究采用尾静脉液压注射方法，通过尾静脉将pCXEGFP-HBVadr2.0直接注射入正常小鼠体内，分别在质粒注射后24，48，72小时取小鼠肝组织块制成冰冻切片，采用荧光显微术和免疫组织化学的方法检测pCXEGFP-HBVadr2.0表达的情况。荧光显微镜观察发现，注射小鼠肝脏组织中表达GFP，其表达量(荧光亮度)在细胞间有差别。免疫组织化学结果显示，HBsAg，HBcAg在注射小鼠肝脏组织中均有表达，阳性细胞散在分布。以上研究结果证实，本研究已成功构建了pCXEGFP-HBVadr2.0真核表达载体，该载体可在体外和体内表达相应的蛋白质，这为体外研究HBV和制备转基因小鼠奠定了基础。为了制备可表达绿色荧光蛋白的HBV全基因组转基因小鼠，本研究将构建成功的pCXEGFP-HBVadr2.0真核表达载体用PstⅠ、NheⅠ限制性内切酶线性化，纯化后采用经典的显微注射法，将10kb大小的DNA片段注射入供体小鼠受精卵雄原核，共注射72枚受精卵，选取状态较好的64枚，分别植入5只假孕小鼠，其中2只已经怀孕，待产仔后做转基因鉴定。
总之，本课题成功构建了含有双拷贝HBV全基因组DNA和EGFP基因的真核表达载体pCXEGFP-HBVadr2.0，体内体外研究证实GFP和HBV基因均能表达，表明pCXEGFP-HBVadr2.0可用于转基因小鼠的制备，且GFP可以作为HBVDNA存在与否的报告基因。进一步用该载体进行转基因小鼠的制备，目前正在等待新生小鼠的产生。