基因剔除小鼠的技术体系是生命科学研究，尤其是人类基因组计划和医学实验动物模型等领域所急需的关健技术。基因剔除小鼠的建立是一项复杂的系统工程。
本研究对基因剔除小鼠技术体系的关键技术环节进行了完善和规范：优化了ES细胞的基本培养条件；应用条件培养液筛选、富集高嵌合潜能的ES细胞；成熟嵌合体的制备技术提高嵌合体的制备效率；改变胚胎的移植方式提高移植胚胎的产仔率等等，建立了一套高效的嵌合体制备体系。在此基础上，本研究还进行了小鼠糖皮质激素受体基因、核孔蛋白155基因和常染色体显性遗传型多囊肾病基因1基因剔除小鼠的研究，并分别获得了嵌合鼠。本研究还进行了诱导型基因剔除小鼠配套的Cre转基因小鼠的制备及Cre重组酶体外活性的检测。 基因剔除小鼠的技术体系是生命科学研究，尤其是人类基因组计划和医学实验动物模型等领域所急需的关健技术。基因剔除小鼠的建立是一项复杂的系统工程，其中涉及打靶载体的构建、ES细胞的培养及筛选、嵌和体的制备、胚胎移植、生殖系传递的检测、建系及表型分析等一系列前后衔接的工作，
本研究旨在完善和规范基因剔除小鼠技术体系的关键技术环节：优化ES细胞的基本培养条件；应用条件培养液筛选、富集高嵌合潜能的ES细胞；成熟嵌合体的制备技术提高嵌合体的制备效率；改变胚胎的移植方式提高移植胚胎的产仔率等等，以建立一套高效的嵌合体制备体系。在此基础上，本研究还进行了小鼠糖皮质激素受体基因、核孔蛋白155基因和常染色体显性遗传型多囊肾病基因1基因剔除小鼠的研究，以及诱导型基因剔除小鼠配套的Cre转基因小鼠的制备及Cre重组酶体外活性的检测。 糖皮质激素受体(GR)介导糖皮质激素在生理和发育上的作用十分复杂，涉及多个器官和系统，产生GR基因缺陷的基因工程小鼠作为相关研究的实验动物模型，对于该领域研究的深入和发展具有重要意义。
本研究旨在采用Cre-loxP系统，建立诱导型GR基因缺陷小鼠模型，从而避免了胚胎发育相关基因的剔除常导致小鼠死于肺发育不良而无法获得成体动物的缺点。同时我们开展了GR组成型基因剔除小鼠的研究，利用杂合子可存活的特点保种并研究纯合子胚胎致死的病理生理学改变。常染色体显性遗传型多囊肾病(ADPKD)是一种常见的单基因遗传性疾病，其主要表现为肾囊肿形成和进行性增大，目前已知大约85％的ADPKD患者由PKD1突变引起。核孔蛋白155基因(NUP155)是国内杨焕明教授克隆的新基因。相关基因剔除小鼠的建立将为相关基因功能的研究提供很好的动物模型。
本研究主要获得如下结果：
一、ES细胞基本培养条件的优化和高嵌合潜能ES细胞的富集ES细胞的基本培养条件是ES细胞体外培养的基础，对基本条件的掌握与优化是本研究的基础内容。本研究在培养试剂的配制与添加、滋养层细胞的制备及ES细胞的培养等方面进行了优化。这些优化措施在减少ES细胞培养环境中的不利影响因素，抑制ES细胞的分化，保持滋养层细胞的健康生长，最好的发挥滋养层细胞的作用以维持ES细胞的未分化状态起到了积极的作用。 随着ES细胞体外培养代数的增加及重组筛选的进行，很容易造成ES细胞的基因突变和染色体畸变，这些变异的细胞通过较短的复制时间或较好的接种效率容易形成生长优势，能很快超过正常的未分化细胞而成为培养环境中的主要细胞，从而导致嵌合体制备的失败。对ES细胞基本培养条件进行优化、抑制细胞分化的同时，如果能反过来将这部分丧失嵌合能力的细胞剔出，而将具有高嵌合潜能的ES细胞富集出来，既保持了ES细胞整体的多向分化潜能，又将大大提高ES细胞的嵌合体制备效率。在研究中，我们发现以改良的条件培养液对ES细胞进行培养筛选，可将已丧失嵌合能力的ES细胞通过促进其分化而淘汰，而将比例较低的具有高嵌合潜能的未分化ES细胞富集出来，这样在制备嵌合体时具有嵌合能力的ES细胞比例大大增加，因而获得嵌合体的概率也大大增加了。通过应用改良的条件培养液改善ES细胞的体外培养条件，嵌合体的制备效率得到很大的改进，这为基因剔除小鼠研究的顺利开展奠定了良好基础。
二、移植胚胎产仔率的提高传统的胚胎移植是采用同步的假孕母鼠。在长期的工作积累中，我们发现，同步的假孕母鼠一般移植10枚胚胎，但真正怀孕的母鼠只占到总体的1/5～1/4，且孕鼠生仔一般在1～5只之间，因此总的产仔率很低(10％左右)。然而将操作后的胚胎移植到同步真孕受体中则可明显提高产仔率，囊胚经注射后移植总的产仔率提高到20％以上，这一移植方法的改进也直接提高了嵌合体的制备效率。本研究改变常规并以此作为胚胎移植的常规方式，该方法也可应用于转基因小鼠及核移植等其它相关的小鼠胚胎移植中。
三、ES细胞经生殖系传递的获得用于打靶载体转染的ES细胞经条件培养液筛选后获得3只85％以上的高度嵌合体，经测交检测均为种系嵌合体，其中1只为100％高效种系传递。这说明该ES细胞株具有高效种系嵌合能力，可用于打靶载体的转染并制备相应的基因剔除小鼠品系。同时也表明我们已建立良好的ES细胞培养及筛选条件，嵌合体制备的技术体系已经成熟。
四、标准化嵌合体制备程序的建立通过对ES细胞基本培养条件的优化、应用条件培养液富集高嵌合潜能的ES细胞；改变胚胎的移植方式提高移植胚胎的产仔率以及对嵌和体制备方式的改进及技术上的成熟，本研究建立了标准化的嵌合体制备程序。目前我们可做到，一个ES克隆注射70～80个囊胚，可获得嵌合体7～9只，其中50％嵌合体3～5只，并能实现生殖系的传递，达到了较高的技术水平。
五、两个工程化ES细胞系的获得将本室构建的GR诱导型基因剔除载体pFlox-GR及NUP155组成型基因剔除载体pTK-Neo-NUP155电穿孔转染ES细胞，以G418筛选抗性克隆，以Southernblot杂交挑选发生了正确同源重组的阳性克隆，分别获得了6个诱导型GR基因缺陷的ES细胞系及5个组成型NUP155基因缺陷的ES细胞系。
六、四个工程化ES细胞系嵌合体小鼠的制备将上述得到的工程化ES细胞系及本室建立的GR及PKD1组成型基因缺陷的ES细胞系制备嵌合体。诱导型GR基因缺陷的ES细胞系获得嵌合体22只；组成型GR基因缺陷的ES细胞系获得嵌合体17只；组成型PKD1基因缺陷的ES细胞系获得嵌合体19只；组成型NUP155基因缺陷的ES细胞系获得嵌合体26只。由四个工程化ES细胞品系共获得84只嵌合鼠，其中50％以上嵌合度的有43只，包括15只嵌合比例达到70％以上。目前对嵌合体的测交实验正在进行中，以期获得经生殖系传递的基因工程小鼠，从而进行相关基因功能的研究。
七、Cre转基因小鼠的制备及Cre重组酶体外活性的检测本研究完成了诱导型基因剔除小鼠配套的Cre转基因小鼠制备及活性检测工作，通过小鼠受精卵雄原核显微注射线性化的质粒pMx-Cre，获得了2个阳性小鼠品系。对已建立的Mx-Cre转基因小鼠给与α-干扰素诱导，通过肝、脾、肾等组织的Western印迹、免疫组织化学及电镜下观察发现，诱导后小鼠肝、脾、肾等组织均可良好的表达Cre酶。电镜观察，Cre酶有相当一部分位于细胞核内，这对其发挥重组DNA的功能至关重要。采用诱导后小鼠组织细胞核提取物(含Cre酶)重组pFlox-GR载体，通过电泳和Southernblot杂交，获得了重组后DNA的阳性结果，从而证实诱导后MX-Cre转基因小鼠表达的Cre酶具有活性。 以上结果表明，本研究完善和规范了基因剔除小鼠技术体系的关键技术环节，建立了一套高效的嵌合体制备程序。在此基础上，分别获得了6个诱导型GR基因缺陷的ES细胞系及5个组成型NUP155基因缺陷的ES细胞系。将上述得到的工程化ES细胞及本室建立的GR及PKD1组成型基因缺陷的ES细胞系制备并分别获得了嵌合体。诱导型基因剔除小鼠配套的Cre转基因小鼠建系成功且表达的Cre酶具有活性。因此我们认为，本研究建立了完善的、规范化的基因剔除小鼠技术体系，已经形成可开放服务的技术能力，可配合我国生命科学及相关学科建设的进一步发展。